1  材料與方法

　　1.1  材料  肉蓯蓉提取物，上海市東方科技公司產(chǎn)品，PBS稀釋成10 mg/ml，22 μm濾膜過濾滅菌；MPP+，Sigma公司產(chǎn)品，無菌蒸餾水稀釋成4 mol/L；胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco‘s modified eagle’s medium， DMEM）、胰蛋白酶，均為Gibco公司產(chǎn)品；GADD153小鼠抗人單克隆抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品；小鼠抗人βactin單克隆抗體，Sigma公司產(chǎn)品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT），荷蘭Duchefa公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（reverse transcriptasepolymerase chain reaction， RTPCR），MBI公司產(chǎn)品；SHSY5Y細(xì)胞，復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室黃芳老師惠贈。

　　1.2  實驗方法

　　1.2.1  細(xì)胞培養(yǎng)及分組  SHSY5Y細(xì)胞每2～3 d用10% DMEM培養(yǎng)液換液1次。待細(xì)胞增長至80%融合時，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1×105分瓶傳代，置于5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。實驗用細(xì)胞分為對照組、MPP+組和肉蓯蓉提取物不同濃度組。用DMEM培養(yǎng)液將MPP+按1∶10梯度稀釋成400 mmol/L，按1∶100體積比例加入96孔板或6孔板中，使MPP+終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L.肉蓯蓉提取物用DMEM培養(yǎng)液按1∶10梯度稀釋成1 mg/ml與10 μg/ml兩個工作濃度。按1∶100加入96孔板或6孔板中，使終濃度分別為1、10和100 μg/ml.6孔板每孔總體積為2 ml，96孔板每孔總體積為200 μl.每項相同實驗均重復(fù)3次。

　　1.2.2  MTT檢測細(xì)胞活性

　　1.2.2.1  MPP+對SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響  1×104密度SHSY5Y細(xì)胞200 μl接種于96孔板，24 h后換含MPP+終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L的培養(yǎng)液，每濃度3復(fù)孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育，分別于6、12、24和48 h時各孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h取出培養(yǎng)板。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide， DMSO）150 μl充分震蕩10 min，待藍(lán)色顆粒完全溶解后用全自動酶標(biāo)儀（Biorad產(chǎn)品）570 nm處測定吸光度值。

　　1.2.2.2  肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞損傷的影響  終濃度1 mmol/L MPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml同時加入96孔板置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h.其余步驟同1.2.2.1.

　　1.2.3  RTPCR檢測GADD153的mRNA表達(dá)  終濃度1 mmol/L MPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、 10和100 μg/ml，同時加入6孔板置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h.取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，按Trizol法提取總RNA.取1 μg RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。聚合酶鏈反應(yīng)總體積為25 μl.引物序列為：GADD153上游引物，5‘GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC3’；下游引物，5‘GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG3’；βactin上游引物，5‘ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC3’；下游引物，5‘TGGCCTTAGGGTTCAGA GGGGC3’。擴(kuò)增目的產(chǎn)物的長度分別為422 bp和244 bp.94 ℃預(yù)變性5 min.循環(huán)參數(shù)為：95 ℃變性0.5 min，60 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物4 μl，電泳后拍照。

　　1.2.4  Western blotting檢測GADD153蛋白表達(dá)  終濃度1 mmol/L MPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml，同時加入6孔板置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h.取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，加入60 μl蛋白裂解液裂解，超聲震蕩，100 ℃變性10 min.用Lowry法測定樣品蛋白濃度。電泳：積層膠60 V 30min，分離膠120 V 90 min；PVDF膜轉(zhuǎn)膜110 V 100 min.加1∶50小鼠抗人GADD153單克隆抗體，4 ℃過夜。TBST溶液洗滌3次，10 min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯影X膠片。膠片用Alpha Image 950自動掃膠系統(tǒng)得到條帶灰度值。每個樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的βactin比較后作統(tǒng)計學(xué)分析。

　　1.3  統(tǒng)計學(xué)方法  采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。計量資料數(shù)據(jù)用x±s表示。

　　2  結(jié)果

　　2.1  MPP+對SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響  不同濃度MPP+作用SHSY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞存活率隨MPP+的濃度增加而降低；MPP+ 1 mmol/L濃度狀態(tài)下細(xì)胞存活率隨時間增長而降低。呈現(xiàn)明顯的量效與時效關(guān)系。見圖1.其中MPP+ 1 mmol/L組在48 h存活率為（45.30±3.21）%，低于50%.故選用1 mmol/L MPP+作為制作帕金森病細(xì)胞模型的處理劑量。

　　圖1  不同濃度MPP+對SHSY5Y存活率的影響（略）

　　Figure 1  Effects of different concentrations of MPP+ on cell viability of SHSY5Y

　　2.2  肉蓯蓉提取物對1 mmol/L MPP+介導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響  肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的損傷有明顯的保護(hù)作用。保護(hù)作用隨濃度增加而加強(qiáng)。MPP+ 1 mmol/L處理的細(xì)胞48 h存活率為（45.30±3.21）%，1 μg/ml肉蓯蓉提取物處理的細(xì)胞存活率為（85.97±3.41）%，10 μg/ml為（129.97±4.84）%，100 μg/ml為（164.10±3.91）%，三種濃度與MPP+ 1 mmol/L對照處理比較，細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示肉蓯蓉提取物不僅有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，而且還可能有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。見圖2.

　　2.3  肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153 mRNA表達(dá)的影響  MPP+ 1 mmol/L處理SHSY5Y細(xì)胞后，在膠上觀察到GADD153 mRNA水平明顯較對照組明亮，統(tǒng)計出的結(jié)果也表明兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。肉蓯蓉提取物組與MPP+ 1 mmol/L處理組相比，GADD153 mRNA水平不僅在膠上顯示出其隨著肉蓯蓉提取物濃度的增加而條帶逐漸變暗，對其掃描統(tǒng)計分析出的結(jié)果也進(jìn)一步證實，肉蓯蓉組GADD153的mRNA水平明顯降低（P＜0.01），且這種降低明顯呈肉蓯蓉劑量的依賴關(guān)系。見圖3.

　　圖2  肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的保護(hù)作用（略）

　　Figure 2  Protective effect of Cistanche extracts on MPP+induced PD cellular model

　　All the three concentrations of Cistanche extracts （CE） had a protective role on the 1 mmol/L MPP+ treatment. MPP+treated cells had a lower viability vs control group， and Cistanche extracts groups exhibited higher viability vs MPP+ group. **P<0.01， vs MPP+ group； △△P<0.01， vs control group.

　　圖3  肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153 mRNA表達(dá)的影響

　　Figure 3  Effects of different concentrations of Cistanche extracts on mRNA expression of GADD153 of MPP+induced PD cellular model

　　mRNA expression of GADD153 in control group， MPP+ group （M）， Cistanche extracts 1 μg/ml  group （CE1）， 10 μg/ml group （CE2） and 100 μg/ml group （CE3）。 mRNA expression of GADD153 increased to a significant level after being treated by 1 mmol/L MPP+， while Cistanche extracts showed excellent capability of decreasing GADD153 mRNA expression.**P<0.01， vs MPP+ group； △△P<0.01， vs control group.

　　2.4  肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153 蛋白表達(dá)的影響  MPP+ 1 mmol/L處理48 h后，Western blotting結(jié)果表明GADD153大量表達(dá)，膠片上的MPP +組印跡的著色明顯較對照組深，且這個結(jié)果與掃描統(tǒng)計后的分析結(jié)果一致（P＜0.01），而1、10和100 μg/ml 肉蓯蓉提取物卻逐漸降低了GADD153蛋白的表達(dá)，且這種表達(dá)與MPP+組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4.

　　圖4  肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153 蛋白表達(dá)的影響（略）

　　Figure 4  Effects of different concentrations of Cistanche extracts on protein expression of GADD153 of MPP+induced PD cellular model

　　Expression of GADD153 protein in control group， MPP+treated cells （M）， Cistanche extracts 1 μg/ml  （CE1）， 10 μg/ml  （CE2） and 100 μg/ml  （CE3）pretreated groups. GADD153 protein expression of MPP+treated cells increased to a significant level， and Cistanche extracts pretreatment decreased the protein expression by a significant level. **P<0.01， vs MPP+ group； △△P<0.01， vs control group.

　　3  討論

　　以往的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中占有很重要的地位［2， 3］。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，ATF6，IRE1和PERK三條通路都可以直接或間接地激活GADD153，進(jìn)而使正常細(xì)胞內(nèi)低水平表達(dá)的GADD153過量表達(dá)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［4，5］。而GADD153敲除小鼠能減少甚至阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)營養(yǎng)因子剝奪所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［6， 7］。帕金森病的典型病理表現(xiàn)是中腦多巴胺能神經(jīng)元的減少，而這種減少目前認(rèn)為多與細(xì)胞凋亡有關(guān)［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在1 mmol/L MPP+處理SHSY5Y細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的存活率已經(jīng)低于50%，而此時GADD153的mRNA和蛋白水平與對照組相比明顯增加（P＜0.01），這一結(jié)果也與Conn等［9］的發(fā)現(xiàn)相一致。因而GADD153的升高與細(xì)胞損傷之間有著緊密的聯(lián)系。肉蓯蓉提取物是從管花肉蓯蓉中分離、純化的一種化合物。中醫(yī)認(rèn)為肉蓯蓉具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便的功效，主治男子陽痿、女子不孕、血枯便秘等證，有“沙漠人參”的美譽(yù)。以往的研究表明肉蓯蓉可以提高多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，還可延長動物壽命和抗衰老。而對肉蓯蓉提取物的研究也表明肉蓯蓉的提取物具有抗凋亡的作用［10~12］。本實驗的MTT結(jié)果表明1、10和100 μg/ml 肉蓯蓉提取物的細(xì)胞存活率均比MPP+組明顯增高（P＜0.01），而且細(xì)胞存活率與肉蓯蓉提取物濃度呈劑量依賴關(guān)系。因此我們的結(jié)果表明肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的損傷具有保護(hù)作用。RTPCR和Western blotting的結(jié)果顯示，GADD153的表達(dá)與對照組相比也明顯降低。其中在肉蓯蓉提取物最高濃度組（100 μg/ml ）GADD153 mRNA水平降到了最低（P＜0.01），Western blotting的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)GADD153的蛋白表達(dá)同時降到了最低（P＜0.01）?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為肉蓯蓉提取物對MPP+介導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控GADD153來實現(xiàn)的。