作者：劉培培， 雍克嵐， 呂敬慈， 欒梅， 張?zhí)鞂?/span>
【關(guān)鍵詞】 龍血竭提取物；,,四氧嘧啶；,,血糖；,,胰島素；,,血清
摘要：目的研究了龍血竭提取物對正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的影響。方法采用正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病模型小鼠，用葡萄糖氧化酶法測定血糖，用放射免疫法測血清胰島素，用高效液相色譜（HPLC）分析小鼠的血清。結(jié)果龍血竭提取物對正常小鼠空腹血糖無明顯降低作用，能降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的空腹血糖水平，能改善小鼠對蔗糖的耐受力，增加正常小鼠的胰島素分泌，血清樣本中有藥物成分檢出。結(jié)論龍血竭提取物對糖尿病小鼠有較好的治療作用，可升高血清胰島素水平，其部分組分能夠被動物體內(nèi)吸收并進(jìn)入血液發(fā)揮作用。
關(guān)鍵詞：龍血竭提取物； 四氧嘧啶； 血糖； 胰島素； 血清
Glucosedecreasing Effect of Extract from Resina Draconis on Mice
Abstract：ObjectiveTo study the effect of extract from on mice. MethodsNormal mice and alloxaninduced diabetic mice were used. Blood glucose was measured with glucose oxidase method, and insulin was measured with radioimmunoassay, and the serum in mice was analyzed by HPLC. ResultsResina Draconis had no obvious effects of decreasing the serum glucose level in normal mice, but could decrease the serum glucose level in alloxaninduced diabetic mice. Also, Resina Draconis improved the sucroseresistance in normal mice and diabetic mice and increased insulin in normal mice. Some of components of Resina Draconis had been measured in serum sample. ConclusionResina Draconis exerts have a good therapeutic effect on alloxaninduced diabetic mice and its mechanism may be related to the increasing of the secretion of insulin and the absorbing of some of the components of Resina Draconis in vivo.
Key words：Resina Draconis; Alloxan; Blood glucose; Insulin; Serum
血竭（Resina Draconis）是中藥的傳統(tǒng)品種之一，被譽為“活血之圣藥”的珍貴中藥，血竭其味甘、咸；性溫、平；歸心、肝經(jīng)；兼有活血化淤，消腫止痛，止血補血之功效［1，2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，血竭具有改善機(jī)體微循環(huán)，調(diào)整新陳代謝，改善免疫功能等作用。具有明顯的抗細(xì)菌、抗真菌、抗氧化、抑制血小板凝集、抗血栓、增強纖溶等活性［3］。近年來有研究表明血竭全粉亦具有治療糖尿病的功效［4］，但其有效部位在治療糖尿病方面的研究尚無報道，其降糖機(jī)制亦不明確。本實驗室以龍血竭為原料經(jīng)過超臨界萃取以及丙酮抽提得到龍血竭的降糖有效部位，觀察了龍血竭提取物對正常小鼠以及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的血糖、血清、血清胰島素的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
1 器材
1.1 龍血竭提取物（Resina Draconis, ERD）龍血竭（廣西中醫(yī)學(xué)院）先采用超臨界CO2萃取（萃取條件：萃取壓力為15 mp，萃取溫度為40℃，萃取時間為2 h，CO2流量30 kg/h），收集萃取殘余物作為活性成分的粗提物，自制一個抽提循環(huán)回流裝置，將活性成分的粗提物裝入回流裝置的浸出器中，加入數(shù)倍量的丙酮溶液，在一定的條件下，抽提數(shù)小時，回收抽提液溶劑并濃縮至干。臨用前用生理鹽水配成所需濃度。
1.2 動物昆明種小鼠，體重20~25 g，雄性，購自上海復(fù)旦醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，合格證號:SCXK滬20020002。
1.3 試劑和儀器四氧嘧啶（alloxan），F(xiàn)luca產(chǎn)品；葡萄糖氧化酶，購自上海維思公司；過氧化物酶，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；疊氮鈉，浙江城關(guān)化工廠產(chǎn)品；胰島素放射免疫分析藥盒，中國生物技術(shù)集團(tuán)公司產(chǎn)品；拜糖蘋（Acarbose），拜耳公司產(chǎn)品；糖適平(格列喹酮, gliquidone), 德國勃林格殷格翰國際公司產(chǎn)品；其余試劑均為市售分析純。紫外分光光度計，日本島津UV260；高速臺式離心機(jī)TGL16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；超臨界流體萃取裝置（HA2205006型），南通市華安超臨界萃取有限公司； Aglient 1100,安捷倫科技有限公司。
2 方法與結(jié)果
2.1 ERD對正常小鼠血糖水平的影響 取50只昆明種小鼠，隨機(jī)分成5組，每組10只，即ERD3個劑量組（100，300，500 mg/kg），陽性對照組（Acarbose，20 mg/kg）及陰性對照組（Control，生理鹽水）。均按0.10 ml/10 g體積灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥前禁食8 h，給藥2 h后眼眶靜脈竇采血，分離血清按葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖［5］，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗。由表1可見，ERD各劑量組動物空腹血糖水平稍有降低，但與對照組比較無顯著差異。這表明血竭提取物各劑量組對正常小鼠血糖無明顯影響，有利于開發(fā)成為降糖中藥制。
2.2 ERD對正常小鼠糖耐量的影響60只小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，即ERD 3個劑量組（100，300，500 mg/kg），陽性對照組（Acarbose，20 mg/kg）及陰性對照組（Control,生理鹽水）。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥前禁食8 h，給藥2 h后眼眶靜脈竇采血，然后灌胃給蔗糖（2.5 g/kg），測定給蔗糖后0.5，1，2 h的血糖值。血糖測定方法同上，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗。由表2可見， ERD高劑量組在1，2 h時有顯著的降血糖作用（P<0.01）,ERD中劑量組在1，2 h時有明顯的降血糖作用（P<0.05）。其效果均優(yōu)于Acarbose。
表1 龍血竭提取物對正常小鼠空腹血糖的影響（略）
2.3 ERD對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影響取100只正常昆明小鼠禁食14 h后，腹腔注射2%四氧嘧啶生理鹽水溶液，注射72 h后眼眶靜脈竇采血，測定空腹血糖（取血前禁食10 h）方法同前。選取血糖高于11.1 mmol?L-1的為糖尿病模型小鼠，根據(jù)血糖水平將糖尿病模型鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型對照組（Model），ERD3個劑量組（500，300，100 mg/kg），模型對照組灌胃生理鹽水，陽性對照組（Acorbose，20 mg/kg），給藥方法均同前，連續(xù)給藥10 d。在末次給藥前8 h禁食，給藥2 h后眼眶靜脈竇取血。血糖測定方法同前，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗。由表3可見，與糖尿病模型組比較，ERD低劑量能夠明顯降低血糖（P<0.05）, ERD中、高劑量組都能顯著降低四氧嘧啶模型小鼠的血糖（P<0.01），與對照組Acarbose具相似降糖效果。
2.4 龍血竭提取物對四氧嘧啶糖尿病小鼠糖耐量實驗取昆明種小鼠100只禁食14 h，造模方法以及血糖測定方法同前。取模型小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型對照組（Model），ERD3個劑量組（500，300，100 mg/kg），陽性對照組（Acorbose，20 mg/kg），模型對照組灌胃生理鹽水，給藥方法均同前，連續(xù)給藥7 d。在末次給藥前8 h禁食，給藥2 h后眼眶靜脈竇采血，然后蔗糖（2.5 g/kg）灌胃，測定給蔗糖后0.5，1，2 h的血糖值。血糖測定方法同上，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗。結(jié)果見表4。由表4可知，四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐量在1 h達(dá)高峰，2 h后下降；3組給藥組小鼠血糖在2 h時均比模型組血糖有了明顯降低（P<0.01）。其中ERD高、中劑量組在1 h時有明顯的降血糖作用（P<0.01），效果優(yōu)于Acarbose。
表2 龍血竭提取物對正常小鼠糖耐量的影響（略）
與陰性對照組比較，*P<0.05 ，**P<0.01；n=12
表3 龍血竭提取物對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖值的影響（略）
與模型組比較，*P<0.05 ，**P<0.01
2.5 ERD對正常小鼠血清胰島素的影響取75只正常昆明小鼠隨機(jī)分為5組，每組15只，即血竭提取物3個劑量組（100，300，500 mg/kg），陽性對照組（糖適平，12 mg/kg）及陰性對照組（Control，生理鹽水）。灌胃給藥，2次/d，連續(xù)14 d，末次給藥前禁食8 h，給藥1 h后眼眶靜脈竇取血，分離血清得供試樣品，用放射免疫分析法測定胰島素（INS）［6］，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗。結(jié)果見表5，ERD中劑量和高劑量能顯著增加小鼠血清胰島素的含量，與對照組有顯著性比較差異（P<0.01）,促胰島素分泌效果與糖適平相近。ERD低劑量也能明顯增加小鼠血清胰島素的含量（P<0.05）。
表4 龍血竭提取物對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的糖耐量實驗（略）
與模型對照組比較，*P<0.05, **P<0.01
表5 龍血竭提取物（EDB）對正常小鼠血清胰島素的影響（略）
與陰性對照組比較，*P<0.05 ，**P<0.01
2.6 ERD對正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血清的影響取上述正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠若干，隨機(jī)分組，即正常小鼠空白血清組、正常小鼠給藥血清組、四氧嘧啶糖尿病模型空白血清組和給藥血清組，200 mg/mlERD懸濁液，灌胃給藥，給藥1 h后取血，分離血清，甲醇沉淀蛋白，離心取上清液，Aglient 1100進(jìn)行分析，分析條件：Zorbax XDBC18，9.4 mm×250 mm，進(jìn)樣量10 μl，流動相：甲醇：乙腈：0.05 mol/L KH2PO4緩沖液＝5∶30∶65，流速：1 ml/min。結(jié)果見圖1~4。通過比較，由下圖可知無論是正常小鼠還是四氧嘧啶糖尿病模型小鼠，空白血清和給藥以后分離的血清，它們的HPLC圖譜均有所不同，給藥組出峰比空白組出峰多，其中最為明顯的是，給藥組均在約17 min的位置上有出峰位置，而在空白血清組的圖譜中卻沒有，此外給藥組還有其他出峰位置，這些亦是空白組血清中所沒有的，這說明ERD能夠被動物體內(nèi)吸收，進(jìn)入血液發(fā)揮作用。
圖1 正常小鼠空白血清（略）
圖2 正常小鼠給藥組血清（略）
圖3 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠空白血清（略）
圖4 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠給藥組血清（略）
3 討論
實驗結(jié)果表明ERD能夠降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平，增加正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠對蔗糖的耐受能力，實驗過程中還觀察到ERD能夠改善糖尿病小鼠多飲、多尿等狀況，對糖尿病小鼠有較好的治療作用，降血糖作用和劑量相關(guān)。另外，ERD對正常動物血糖影響較小，有利于今后開發(fā)成為低毒的降糖中藥制劑。在利用高效液相色譜分析正常和糖尿病模型小鼠的血清的過程中，發(fā)現(xiàn)給藥后，在小鼠血清中檢出若干組分，這些組分是空白小鼠血清中所沒有的，這說明ERD能夠被動物體內(nèi)吸收并發(fā)揮其降糖作用，這些組分到底是什么物質(zhì)還有待于進(jìn)一步的深入研究，此外，ERD還能夠促進(jìn)正常小鼠胰島素的分泌，這些都可能和ERD降血糖作用的機(jī)理有關(guān)，為ERD降糖機(jī)理的進(jìn)一步研究奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。
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