首頁 > 產(chǎn)品學術 > 學術論文    龍血竭對組織工程皮膚修復皮膚缺損的作用

   作者：劉愛軍 朱永紅 趙鐘祥 張立群 杜標炎 鄺棗園 李彩霞 易華

【摘要】   　　[目的]觀察龍血竭對組織工程皮膚修復皮膚缺損創(chuàng)面的促進作用。[方法]將人成纖維細胞種植入膠原海綿，人角質(zhì)形成細胞種植在表層，構建組織工程皮膚，并移植入裸鼠皮膚缺損創(chuàng)面;實驗動物隨機分為4組，選用"活血圣藥"龍血竭于移植后2d分別進行創(chuàng)面外敷、單純口服、創(chuàng)面外敷+口服 治療 ，并設空白對照組。組織工程皮膚移植后9d取材檢測，觀察創(chuàng)面局部表皮厚度、真皮層中層粘連蛋白(Ln)、Ⅰ型膠原蛋白的表達及毛細血管增生情況。[結果]龍血竭能促進組織工程皮膚移植后表皮的發(fā)育及真皮層中毛細血管的增生,增強Ln、Ⅰ型膠原蛋白的分泌，龍血竭外敷+口服組效果最佳。[結論]龍血竭對組織工程皮膚修復皮膚創(chuàng)面有促進作用。

【關鍵詞】   龍血竭/藥 理學 皮膚缺損/中西醫(yī)結合療法 皮膚移植 組織工程皮膚/病理學 細胞培養(yǎng)

　　大面積的皮膚缺損需要皮膚移植進行修復，皮源不足是最大的問題，許多患者往往因難以實現(xiàn)及時的救護，而導致感染、多器官功能衰竭等嚴重并發(fā)癥甚至死亡。組織工程皮膚是利用來源于自體或異體的皮膚細胞，與適宜的真皮支架復合，在體外構建而成的皮膚類似物，將其移植入皮膚缺損創(chuàng)面，修復缺損的皮膚,為解決皮膚移植中的皮源不足問題提供了光明前景。但目前組織工程皮膚移植后存在表皮層薄、血管化進程慢等問題，導致移植成功率低[1]。

　　祖國傳統(tǒng)醫(yī)學在治療皮膚創(chuàng)傷方面有著悠久的 歷史 ，"生肌法"是中醫(yī)藥治療皮膚創(chuàng)傷的一項重要治則，生肌中藥通過"收斂止血、活血化瘀、祛腐生肌"等作用修復缺損的皮膚。本研究將構建的組織工程皮膚移植后，利用活血圣藥龍血竭作用于移植處，觀察創(chuàng)面微環(huán)境的變化，探討利用生肌中藥促進組織工程皮膚修復創(chuàng)面的可能性，現(xiàn)報道如下。

　 　1 材料與方法

　　1.1 主要材料 高糖DMEM及低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津灝洋生物制品科技有限公司);25cm2塑料培養(yǎng)瓶(Coning公司);胰蛋白酶及II型(本文來自中科軟件園www.4oa.com，轉(zhuǎn)載請注明！)膠原酶(均為Sigma公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。龍血竭購自廣州市杏園春大藥房;幼兒包皮取自中山一院兒外科無菌切除標本(病人家屬知情);人角質(zhì)形成細胞購自中山大學北校區(qū)實驗動物中心;膠原海綿購自廣州市創(chuàng)爾生物技術有限公司。

　　1.2 實驗動物 SPF級裸鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量約20g，購自本校實驗動物中心，合格證號：SCXK粵20030001，粵監(jiān)證字2007A015。

　　1.3 免疫熒光試劑及儀器 Ⅰ抗層粘連蛋白(Ln)(博士得生物試劑公司);Ⅰ型膠原(Sigma公司);Ⅱ抗為紅色熒光探針(Cy3)標記的山羊抗小鼠IgG(IgGCy3)，核標記物為二脒基苯基吲哚(DAPI)，均購自Sigma公司;IX71奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(日本)。

　　1.4 實驗方法

　　1.4.1 人皮膚細胞的培養(yǎng) 取無菌切除術后幼兒包皮，于超凈工作臺上用含青霉素2×105U/L、鏈霉素200mg/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，盡可能剔除皮下組織，剪成約2mm×2mm小塊，置于1g/L Ⅱ型膠原酶消化液中消化過夜(4℃、約18h)，分離表皮和真皮。將真皮剪碎，然后轉(zhuǎn)移至2.5g/L胰蛋白酶中約15min，以含體積分數(shù)10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000r/min離心3min，將沉淀物接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，以含體積分數(shù)10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液分離培養(yǎng)人包皮成纖維細胞。角質(zhì)形成細胞以含體積分數(shù)10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)傳代。

　　1.4.2 組織工程皮膚的構建 將無菌的膠原海綿剪成1cm×1cm×0.2cm小塊，放入無菌24孔板內(nèi)，取第3～5代人包皮成纖維細胞，按1×105個/cm2將細胞種植于膠原海綿兩面，體積分數(shù)5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)3～4h。將人角質(zhì)形成細胞以1×105個/cm2密度接種于單面膠原海綿，無菌培養(yǎng)3～4h。

　　1.4.3 組織工程皮膚的移植 SPF級裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/kg劑量)，固定于手術臺上，嚴格消毒后，沿背部正中線左右距脊柱約0.5cm處皮膚呈"C"形切開，形成皮瓣，分離皮下組織至深筋膜，暴露肌層，切口大小約1cm2。將體外構建的組織工程皮膚覆蓋到全層皮膚缺損的創(chuàng)面，再用無菌凡士林紗布覆蓋，單針縫線固定皮瓣于正常皮膚上，無菌紗布包扎。術后2d拆除敷料，剪掉皮瓣。單籠飼養(yǎng)。

　　1.4.4 實驗分組 實驗動物隨機分為4組，每組4只，分為龍血竭外敷組(隔天換藥)、內(nèi)服(按70mg·kg-1·d-1劑量灌胃)組、外敷+內(nèi)服組，不用藥者為空白對照組。于術后9d取材檢測，單籠飼養(yǎng)。

　　1.4.5 免疫熒光檢測 術后9d取材，連同周邊正常皮膚剪去稍許，4℃、40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定6～8h，300g/L蔗糖液中過夜，冰凍切片，片厚8μm，部分行蘇木素-伊紅(HE)染色，分別行層粘連蛋白(Ln)、Ⅰ型膠原抗體免疫熒光組織化學染色，Ⅰ抗?jié)舛染鶠?：100。Ⅱ抗IgGCy3濃度為1：100。封片劑為甘油PBS(甘油：PBS體積比為9：1)。

　　免疫熒光組織化學染色步驟：冰凍切片，PBS(0.01mol/L，pH=7.4)洗3遍;體積分數(shù)3%正常羊血清封閉，室溫，30min;分別加Ⅰ抗Ln、Ⅰ型膠原，4℃過夜后PBS洗3遍;加Ⅱ抗山羊抗小鼠IgGCy3室溫下孵育1h后PBS洗3遍;DAPI復染核15min;甘油PBS封片，熒光顯微鏡觀察。

2 結果

　　2.1 各組組織學檢測結果 空白對照組：創(chuàng)面處皮膚表皮較正常皮膚厚,基底層與真皮層交界局部連接欠佳(圖1-a，彩圖見第315頁)。龍血竭 治療 各組標本表皮細胞分層明顯，排列整齊，表皮和真皮連接緊密(圖1-b、c、d，彩圖見第315頁)，真皮層中有毛細血管增生，龍血竭外用+內(nèi)服組真皮層中新生毛細血管最豐富(圖1-e，彩圖見第315頁)?？瞻讓φ战M及各實驗組均未觀察到汗腺、皮脂腺等皮膚附屬器結構。中科軟件園http://www.4oa.com

　　2.2 免疫熒光檢測結果 組織工程皮膚移植后9d，空白對照組標本真皮層中有少量散在Ln表達陽性細胞，表皮真皮交界處可見Ln表達陽性(圖2-a，彩圖見第315頁)。龍血竭治療各組標本真皮層中Ln表達陽性細胞增多增強，表皮真皮交界處亦可見Ln表達陽性(圖2-b、c、d，彩圖見第315頁)，其中外敷+內(nèi)服組Ln呈明顯的連續(xù)性表達(圖2-d，彩圖見第315頁)。

　　組織工程皮膚移植后9d，空白對照組標本真皮層中可見散在Ⅰ型膠原表達陽性細胞(圖3-a，彩圖見第316頁)。龍血竭治療各組標本真皮層中Ⅰ型膠原表達陽性細胞增多(圖3-b、c、d，彩圖見第316頁)，龍血竭外用+內(nèi)服組真皮層中DAPi標記細胞Ⅰ型膠原表達最為明顯(圖3-d，彩圖見第316頁)。

　 　3 討論

　　組織工程皮膚的出現(xiàn)不僅可以解決因各種原因引起的皮膚缺損問題，而且在治療瘢痕攣縮及整形美容等領域都有重要的應用價值[2]，"生肌法"是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學在醫(yī)療實踐中形成的重要治則，時至今日仍顯示出獨特的優(yōu)勢，但生肌中藥應用于組織工程皮膚的研究尚未查及。

　　血竭(Sanguis draxonis)是中藥外治皮膚損傷中最常用的生肌藥物[3]，古人對血竭的效用極為推崇，在李時珍的《本草綱目》中已有詳細記載：血竭性平，味甘、咸，無毒，歸心、肝、腎三經(jīng)，具有活血化瘀、祛腐生肌、消炎鎮(zhèn)痛、止血斂瘡、軟堅散結等作用，被譽為"活血圣藥"。

　　皮膚創(chuàng)面修復是一個復雜的生物學過程， 現(xiàn)代 醫(yī)學研究認為皮膚創(chuàng)面修復是局部炎癥反應、成纖維細胞增殖并分泌大量細胞外基質(zhì)、新生血管長入缺損部位及表皮細胞遷移、增殖、分化、重新覆蓋創(chuàng)面等過程綜合作用的結果[4]。

　　細胞外基質(zhì)主要包括膠原、層粘連蛋白(laminin，Ln)、纖維結合蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、氨基葡聚糖和蛋白聚糖等成分。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，Ⅰ型膠原可促進表皮細胞的遷移，使創(chuàng)面再上皮化，上皮化過程又可抑制膠原的過度增生，減少瘢痕的形成[5]，在(本文來自中科軟件園www.4oa.com，轉(zhuǎn)載請注明！)創(chuàng)面修復及瘢痕治療中具有重要意義。Ln是基膜的主要成分，基膜位于表皮和真皮之間，在創(chuàng)面愈合過程中能使表皮與真皮結合得更加牢固，并使再上皮化的過程得以終止[6]，因此基膜重建及功能正?；墙M織工程皮膚修復創(chuàng)面的一個重要指標。

　　本研究結果顯示，龍血竭作用于組織工程皮膚移植后的動物模型，在炎癥早期能促進Ln、Ⅰ型膠原等細胞外基質(zhì)成分增加，提示龍血竭能促進皮膚細胞的增殖分化及分泌，并促進毛細血管重新生成，血供增加，進而促進組織工程皮膚對皮膚創(chuàng)面的修復。利用中藥的生肌功效有望改進或解決目前組織工程皮膚研究中存在的血管化進程慢、移植成功率低等問題。

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