首頁 > 產(chǎn)品學(xué)術(shù) > 學(xué)術(shù)論文    龍血竭對(duì)組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損的作用

   作者：劉愛軍 朱永紅 趙鐘祥 張立群 杜標(biāo)炎 鄺棗園 李彩霞 易華

【摘要】   　　[目的]觀察龍血竭對(duì)組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損創(chuàng)面的促進(jìn)作用。[方法]將人成纖維細(xì)胞種植入膠原海綿，人角質(zhì)形成細(xì)胞種植在表層，構(gòu)建組織工程皮膚，并移植入裸鼠皮膚缺損創(chuàng)面;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，選用"活血圣藥"龍血竭于移植后2d分別進(jìn)行創(chuàng)面外敷、單純口服、創(chuàng)面外敷+口服 治療 ，并設(shè)空白對(duì)照組。組織工程皮膚移植后9d取材檢測(cè)，觀察創(chuàng)面局部表皮厚度、真皮層中層粘連蛋白(Ln)、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)及毛細(xì)血管增生情況。[結(jié)果]龍血竭能促進(jìn)組織工程皮膚移植后表皮的發(fā)育及真皮層中毛細(xì)血管的增生,增強(qiáng)Ln、Ⅰ型膠原蛋白的分泌，龍血竭外敷+口服組效果最佳。[結(jié)論]龍血竭對(duì)組織工程皮膚修復(fù)皮膚創(chuàng)面有促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】   龍血竭/藥 理學(xué) 皮膚缺損/中西醫(yī)結(jié)合療法 皮膚移植 組織工程皮膚/病理學(xué) 細(xì)胞培養(yǎng)

　　大面積的皮膚缺損需要皮膚移植進(jìn)行修復(fù)，皮源不足是最大的問題，許多患者往往因難以實(shí)現(xiàn)及時(shí)的救護(hù)，而導(dǎo)致感染、多器官功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡。組織工程皮膚是利用來源于自體或異體的皮膚細(xì)胞，與適宜的真皮支架復(fù)合，在體外構(gòu)建而成的皮膚類似物，將其移植入皮膚缺損創(chuàng)面，修復(fù)缺損的皮膚,為解決皮膚移植中的皮源不足問題提供了光明前景。但目前組織工程皮膚移植后存在表皮層薄、血管化進(jìn)程慢等問題，導(dǎo)致移植成功率低[1]。

　　祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療皮膚創(chuàng)傷方面有著悠久的 歷史 ，"生肌法"是中醫(yī)藥治療皮膚創(chuàng)傷的一項(xiàng)重要治則，生肌中藥通過"收斂止血、活血化瘀、祛腐生肌"等作用修復(fù)缺損的皮膚。本研究將構(gòu)建的組織工程皮膚移植后，利用活血圣藥龍血竭作用于移植處，觀察創(chuàng)面微環(huán)境的變化，探討利用生肌中藥促進(jìn)組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面的可能性，現(xiàn)報(bào)道如下。

　 　1 材料與方法

　　1.1 主要材料 高糖DMEM及低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?;25cm2塑料培養(yǎng)瓶(Coning公司);胰蛋白酶及II型(本文來自中科軟件園www.4oa.com，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明！)膠原酶(均為Sigma公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。龍血竭購自廣州市杏園春大藥房;幼兒包皮取自中山一院兒外科無菌切除標(biāo)本(病人家屬知情);人角質(zhì)形成細(xì)胞購自中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;膠原海綿購自廣州市創(chuàng)爾生物技術(shù)有限公司。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)裸鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量約20g，購自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK粵20030001，粵監(jiān)證字2007A015。

　　1.3 免疫熒光試劑及儀器 Ⅰ抗層粘連蛋白(Ln)(博士得生物試劑公司);Ⅰ型膠原(Sigma公司);Ⅱ抗為紅色熒光探針(Cy3)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(IgGCy3)，核標(biāo)記物為二脒基苯基吲哚(DAPI)，均購自Sigma公司;IX71奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(日本)。

　　1.4 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.4.1 人皮膚細(xì)胞的培養(yǎng) 取無菌切除術(shù)后幼兒包皮，于超凈工作臺(tái)上用含青霉素2×105U/L、鏈霉素200mg/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，盡可能剔除皮下組織，剪成約2mm×2mm小塊，置于1g/L Ⅱ型膠原酶消化液中消化過夜(4℃、約18h)，分離表皮和真皮。將真皮剪碎，然后轉(zhuǎn)移至2.5g/L胰蛋白酶中約15min，以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000r/min離心3min，將沉淀物接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液分離培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)傳代。

　　1.4.2 組織工程皮膚的構(gòu)建 將無菌的膠原海綿剪成1cm×1cm×0.2cm小塊，放入無菌24孔板內(nèi)，取第3～5代人包皮成纖維細(xì)胞，按1×105個(gè)/cm2將細(xì)胞種植于膠原海綿兩面，體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)3～4h。將人角質(zhì)形成細(xì)胞以1×105個(gè)/cm2密度接種于單面膠原海綿，無菌培養(yǎng)3～4h。

　　1.4.3 組織工程皮膚的移植 SPF級(jí)裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/kg劑量)，固定于手術(shù)臺(tái)上，嚴(yán)格消毒后，沿背部正中線左右距脊柱約0.5cm處皮膚呈"C"形切開，形成皮瓣，分離皮下組織至深筋膜，暴露肌層，切口大小約1cm2。將體外構(gòu)建的組織工程皮膚覆蓋到全層皮膚缺損的創(chuàng)面，再用無菌凡士林紗布覆蓋，單針縫線固定皮瓣于正常皮膚上，無菌紗布包扎。術(shù)后2d拆除敷料，剪掉皮瓣。單籠飼養(yǎng)。

　　1.4.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組4只，分為龍血竭外敷組(隔天換藥)、內(nèi)服(按70mg·kg-1·d-1劑量灌胃)組、外敷+內(nèi)服組，不用藥者為空白對(duì)照組。于術(shù)后9d取材檢測(cè)，單籠飼養(yǎng)。

　　1.4.5 免疫熒光檢測(cè) 術(shù)后9d取材，連同周邊正常皮膚剪去稍許，4℃、40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定6～8h，300g/L蔗糖液中過夜，冰凍切片，片厚8μm，部分行蘇木素-伊紅(HE)染色，分別行層粘連蛋白(Ln)、Ⅰ型膠原抗體免疫熒光組織化學(xué)染色，Ⅰ抗?jié)舛染鶠?：100。Ⅱ抗IgGCy3濃度為1：100。封片劑為甘油PBS(甘油：PBS體積比為9：1)。

　　免疫熒光組織化學(xué)染色步驟：冰凍切片，PBS(0.01mol/L，pH=7.4)洗3遍;體積分?jǐn)?shù)3%正常羊血清封閉，室溫，30min;分別加Ⅰ抗Ln、Ⅰ型膠原，4℃過夜后PBS洗3遍;加Ⅱ抗山羊抗小鼠IgGCy3室溫下孵育1h后PBS洗3遍;DAPI復(fù)染核15min;甘油PBS封片，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

　　2.1 各組組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果 空白對(duì)照組：創(chuàng)面處皮膚表皮較正常皮膚厚,基底層與真皮層交界局部連接欠佳(圖1-a，彩圖見第315頁)。龍血竭 治療 各組標(biāo)本表皮細(xì)胞分層明顯，排列整齊，表皮和真皮連接緊密(圖1-b、c、d，彩圖見第315頁)，真皮層中有毛細(xì)血管增生，龍血竭外用+內(nèi)服組真皮層中新生毛細(xì)血管最豐富(圖1-e，彩圖見第315頁)。空白對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組均未觀察到汗腺、皮脂腺等皮膚附屬器結(jié)構(gòu)。中科軟件園http://www.4oa.com

　　2.2 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 組織工程皮膚移植后9d，空白對(duì)照組標(biāo)本真皮層中有少量散在Ln表達(dá)陽性細(xì)胞，表皮真皮交界處可見Ln表達(dá)陽性(圖2-a，彩圖見第315頁)。龍血竭治療各組標(biāo)本真皮層中Ln表達(dá)陽性細(xì)胞增多增強(qiáng)，表皮真皮交界處亦可見Ln表達(dá)陽性(圖2-b、c、d，彩圖見第315頁)，其中外敷+內(nèi)服組Ln呈明顯的連續(xù)性表達(dá)(圖2-d，彩圖見第315頁)。

　　組織工程皮膚移植后9d，空白對(duì)照組標(biāo)本真皮層中可見散在Ⅰ型膠原表達(dá)陽性細(xì)胞(圖3-a，彩圖見第316頁)。龍血竭治療各組標(biāo)本真皮層中Ⅰ型膠原表達(dá)陽性細(xì)胞增多(圖3-b、c、d，彩圖見第316頁)，龍血竭外用+內(nèi)服組真皮層中DAPi標(biāo)記細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)最為明顯(圖3-d，彩圖見第316頁)。

　 　3 討論

　　組織工程皮膚的出現(xiàn)不僅可以解決因各種原因引起的皮膚缺損問題，而且在治療瘢痕攣縮及整形美容等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價(jià)值[2]，"生肌法"是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在醫(yī)療實(shí)踐中形成的重要治則，時(shí)至今日仍顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但生肌中藥應(yīng)用于組織工程皮膚的研究尚未查及。

　　血竭(Sanguis draxonis)是中藥外治皮膚損傷中最常用的生肌藥物[3]，古人對(duì)血竭的效用極為推崇，在李時(shí)珍的《本草綱目》中已有詳細(xì)記載：血竭性平，味甘、咸，無毒，歸心、肝、腎三經(jīng)，具有活血化瘀、祛腐生肌、消炎鎮(zhèn)痛、止血斂瘡、軟堅(jiān)散結(jié)等作用，被譽(yù)為"活血圣藥"。

　　皮膚創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程， 現(xiàn)代 醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為皮膚創(chuàng)面修復(fù)是局部炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)、新生血管長(zhǎng)入缺損部位及表皮細(xì)胞遷移、增殖、分化、重新覆蓋創(chuàng)面等過程綜合作用的結(jié)果[4]。

　　細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原、層粘連蛋白(laminin，Ln)、纖維結(jié)合蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、氨基葡聚糖和蛋白聚糖等成分。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，Ⅰ型膠原可促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移，使創(chuàng)面再上皮化，上皮化過程又可抑制膠原的過度增生，減少瘢痕的形成[5]，在(本文來自中科軟件園www.4oa.com，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明！)創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕治療中具有重要意義。Ln是基膜的主要成分，基膜位于表皮和真皮之間，在創(chuàng)面愈合過程中能使表皮與真皮結(jié)合得更加牢固，并使再上皮化的過程得以終止[6]，因此基膜重建及功能正?；墙M織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面的一個(gè)重要指標(biāo)。

　　本研究結(jié)果顯示，龍血竭作用于組織工程皮膚移植后的動(dòng)物模型，在炎癥早期能促進(jìn)Ln、Ⅰ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，提示龍血竭能促進(jìn)皮膚細(xì)胞的增殖分化及分泌，并促進(jìn)毛細(xì)血管重新生成，血供增加，進(jìn)而促進(jìn)組織工程皮膚對(duì)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。利用中藥的生肌功效有望改進(jìn)或解決目前組織工程皮膚研究中存在的血管化進(jìn)程慢、移植成功率低等問題。

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