【摘要】： 前言 地龍(earthworm)又稱蚯蚓，別名“地龍子”，系無脊椎動(dòng)物，是生物進(jìn)化過程中最先具有免疫記憶和識(shí)別的動(dòng)物之一，廣泛分布于我國(guó)各地。具有清熱平肝、消炎止痛、活血化淤及主治高熱狂燥等功效，可治療20多種疾病，是我國(guó)寶貴的中藥材之一。臨床上地龍肽常被用于治療細(xì)菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病和腫瘤。近年來人們從地龍?bào)w內(nèi)提取了多種具有生物活性的肽類，如纖維蛋白溶解酶、催產(chǎn)素相關(guān)肽、肌肉運(yùn)動(dòng)活性肽等。地龍肽是地龍?bào)w內(nèi)小分子多肽的總稱，種類繁多，生物功能復(fù)雜多樣。具有免疫活性的地龍肽，因其具有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能的作用越來越引起人們的關(guān)注。例如地龍?zhí)崛∥颎-90和912對(duì)黑色素瘤和喉癌等腫瘤有明顯的抑制作用，912可增加胸腺、脾的重量以及細(xì)胞數(shù)目，消除放療引起的T細(xì)胞免疫功能的低下和輻射引起的體液免疫功能低下。粗分離的地龍?zhí)崛∥锟梢曰罨奘杉?xì)胞，提高NK、LAK細(xì)胞的活性，增強(qiáng)ADCC效應(yīng)。但這些地龍?zhí)崛∥镏苽浜?jiǎn)單，成分復(fù)雜，分子量大，藥效低，副作用大，不利于其藥理機(jī)制的研究。本試驗(yàn)所用的地龍肽(lumbricus peptide，LP)是經(jīng)過清洗、破碎、抽提、離心、過濾、超濾及色譜等步驟從新鮮正蚓科(lumbricidea)愛勝屬赤子愛勝蚓(Eiscmia foctida)體內(nèi)提取的小分子量多肽，純度較高，是由幾種8000～20000Dal的多肽組成。本實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)地龍肽在體外實(shí)驗(yàn)中可明顯增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，提高NK殺傷率，同IL-2有協(xié)同作用，拮抗環(huán)磷酰胺和地塞米松的免疫抑制作用。但是尚不清楚此地龍肽對(duì)于巨噬細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞以及細(xì)胞因子分泌水平的影響，同時(shí)小鼠體外實(shí)驗(yàn)條件不能代表小 鼠整個(gè)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)擬建立小鼠地龍肽給藥模型和免 疫抑制模型，在體外進(jìn)一步探討地龍肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影 響，同時(shí)還進(jìn)一步研究地龍肽對(duì)巨噬細(xì)胞及脾細(xì)胞生物活性影響 的作用機(jī)制，為地龍肽將來能應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料 1．藥品與試劑： 地龍肽：按本試驗(yàn)室方法制備，共有7種多肽成分，分子量為 8000—－20000Dal，經(jīng)E花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)具有提高E花環(huán)形 成能力，用時(shí)以蒸餾水配成不同的濃度；環(huán)磷酸胺（Cyclophospha－ mide，Cy，上海華聯(lián)制藥有公司，200mg／支h 10％FCS RPMI－ 1640（胎牛血清為華美生物制劑生產(chǎn)八0．5％BSA RPMI－1640 （牛血清白蛋白為北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心生物工程研究室產(chǎn)＊吩 嗓H甲酉硫酸鹽即PMS（Bioche而ka）；氧化型輔酶1即NAD（Bio－ tee八左旋乳酸（siglna）；碘硝基氯化四氮哩即INTk 入細(xì)菌脂 多糖（LPS人 GreSS試劑規(guī)TI’等。 2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： C57BL／6純系小鼠，雌雄各半，體重 20。Zg，6edw，購(gòu)于本 校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。 s．腫瘤細(xì)胞系：小鼠紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞（Ya－l）株，小鼠 成纖維瘤細(xì)胞（p29）株，由本實(shí)驗(yàn)室提供，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)方法 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物贈(zèng)及給藥： C57BL／6純系小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組10只，第二 組為正常對(duì)照組，第2組為低濃度p．lin砂Inl）給藥組，第3組為 ·2· 中濃度N．5 mg／Inl）給藥組，第 4組為高濃度門 mg／nil）給藥組，第 5組為環(huán)磷酸胺組，第 6組為環(huán)磷酸胺十地龍肽N．5 mg／Inl）組；2 3戶、6組分別以不同濃度的地龍肽灌胃，每日一次，每次0．ZInl， 連續(xù)7日，其中5在gg于給藥第三天肌注Cy100mg／k，一次，＼5 組每日以蒸餾水灌胃0．ZInl。各組均于第8天觀察各項(xiàng)指標(biāo)。 2．NK細(xì)胞活性的測(cè)定：采用乳酸脫氫酶法。 3．巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定：采用中性紅法。 4．NO測(cè)定：采用童氮化反應(yīng)法。 5．TNF心測(cè)定：采用n29細(xì)胞作為敏感靶細(xì)胞 6．巨噬細(xì)胞毒效應(yīng)測(cè)定規(guī)rIT比色分析法 7．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：采用t檢驗(yàn)，方差分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．口服地龍肽對(duì)小鼠脾細(xì)胞中NK細(xì)胞殺傷率的影響 地龍肽在濃度為0．lin礦nl刀．sin牙IYl和linyInl時(shí)，均可顯 著提高＊K細(xì)胞的活性人P＜O．01L且濃度越大效果越明顯；環(huán) 磷酸胺作為免疫抑制劑可以從多方面抑制機(jī)體的免疫功能，其對(duì) NK細(xì)胞亦有明顯的抑制作用；環(huán)磷酸胺組與正常組相比。自然殺 傷率降低，地龍肽可明顯桔抗環(huán)磷酸胺的抑制作用汗＜o(jì)．05八 2．口服地龍肽對(duì)小鼠腹腔＊ 吞噬功能的影響 與正常組相比較，地龍肽在各濃度N．ling／nd刀．5 mg／lld、 ling／ml）均能提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后只有 低濃度組效果顯著u＜0．01L環(huán)磷酸胺十地龍肽組巨噬細(xì)胞吞 噬功能與環(huán)磷酸胺組相比較作用明顯增強(qiáng)（P＜O．05X說明地龍 肽可明顯桔抗環(huán)磷酸胺的抑制作用。 3．地龍肽體外對(duì)小鼠腹腔腫和脾細(xì)胞分泌NO的影響 0．L…giL LP可明顯提高巨噬細(xì)胞和牌細(xì)胞自發(fā)及經(jīng) LPS ·3· 誘生分泌＊o水平u＜o(jì)．01人且劑量越大，其作用逐漸減弱；地 塞米松作用于巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞后對(duì)．l上上＊
【關(guān)鍵詞】：地龍肽免疫功能NKM(?)NOTNF-α小鼠
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R285.5
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2003.091921
